Guía práctica para la solicitud de marcadores humorales de autoinmunidad y estudios genéticos en diabetes mellitus / A practical guide to request humoral autoimmunity markers and genetic tests in diabetes mellitus

La diabetes mellitus (DM) es una enfermedad heterogénea que presenta fenotipos clínicos diversos, todos con hiperglucemia. Históricamente se han utilizado cuatro factores para identificar esta diversidad: la edad de inicio, la gravedad de la enfermedad o grado de pérdida de la función de la célula beta, el grado de resistencia a la insulina y la presencia de autoanticuerpos asociados a la enfermedad. Actualmente, los parámetros empleados para clasificar los diferentes tipos de DM dificultan el diagnóstico y tratamiento de los pacientes. Las distintas presentaciones clínicas requieren una clasificación diagnóstica más eficaz para un abordaje terapéutico más preciso, valiéndose del avance de la inmunogenética y la bioquímica clínica. Esta guía está orientada a clasificar con precisión las presentaciones clínicas que a menudo generan incertidumbre dentro de los dos tipos principales de DM.

Diabetes mellitus (DM) is a heterogeneous disease, with diverse clinical phenotypes, all with hyperglycemia. Historically, four factors have been used to identify this diversity: the age at onset, the severity of the disease, that is, the degree of loss of beta cell function and insulin resistance, and the presence of circulating autoantibodies. Currently, the parameters used to classify the different types of DM make it difficult to diagnose and treat patients. The different clinical manifestations require an accurate diagnosis to achieve an effective therapeutic approach through the use of immunogenetics and clinical biochemistry. This practical guide aims to accurately classify the often uncertain clinical presentations within the two main types of diabetes.

Guía práctica para la solicitud de marcadores humorales de autoinmunidad y estudios genéticos en diabetes mellitus / A practical guide to request humoral autoimmunity markers and genetic tests in diabetes mellitus

Resumen La diabetes mellitus (DM) es una enfermedad heterogénea que presenta fenotipos clínicos diversos, todos con hiperglucemia. Históricamente se han utilizado cuatro factores para identificar esta diversidad: la edad de inicio, la gravedad de la enfermedad o grado de pérdida de la función de la célula beta, el grado de resistencia a la insulina y la presencia de autoanticuerpos asociados a la enfermedad. Actualmente, los parámetros empleados para clasificar los diferentes tipos de DM dificultan el diagnóstico y tratamiento de los pacientes. Las distintas presentaciones clínicas requieren una clasificación diagnóstica más eficaz para un abordaje terapéutico más preciso, valiéndose del avance de la inmunogenética y la bioquímica clínica. Esta guía está orientada a clasificar con precisión las presentaciones clínicas que a menudo generan incertidumbre dentro de los dos tipos principales de DM.

Abstract Diabetes mellitus (DM) is a heterogeneous disease, with diverse clinical phenotypes, all with hyperglycemia. Historically, four factors have been used to identify this diversity: the age at onset, the severity of the disease, that is, the degree of loss of beta cell function and insulin resistance, and the presence of circulating autoantibodies. Currently, the parameters used to classify the different types of DM make it difficult to diagnose and treat patients. The different clinical manifestations require an accurate diagnosis to achieve an effective therapeutic approach through the use of immunogenetics and clinical biochemistry. This practical guide aims to accurately classify the often uncertain clinical presentations within the two main types of diabetes.

Inmunoensayo multiplex para el diagnóstico simultáneo de diabetes mellitus autoinmune y enfermedad celíaca / Multiplex immunoassay for simultaneous diagnostic of autoimmune diabetes mellitus and celiac disease

Introducción: la diabetes mellitus autoinmune (DMA) y la enfermedad celíaca (EC) son enfermedades crónicas, poligénicas y multifactoriales vinculadas con la disfunción del sistema inmune. Dado que es frecuente que un mismo paciente presente ambas patologías, la detección simultánea de los marcadores de autoinmunidad de DMA y EC sería una estrategia racional para mejorar el diagnóstico. Objetivos: desarrollar un inmunoensayo basado en citometría de flujo (FloCMIA multiplex) para la detección simultánea y discriminativa de marcadores de DMA (GADA e IA-2A) y de EC (tTgA). Materiales y métodos: las muestras analizadas consistieron en sueros provenientes de 35 individuos controles normales y 21 pacientes con diabetes mellitus tipo 1 (DM1). Se empleó un modelo de "doble paratope" incubando los sueros con una mezcla de microesferas de diferente fluorescencia interna, cada una adsorbida con un autoantígeno: TrxGAD, TrxIA-2 o H6-tTg, y una mezcla de dichos autoantígenos biotinilados. Los inmunocomplejos se detectaron con estreptavidina-ficoeritrina y se adquirió en un citómetro de flujo. Resultados: FloCMIA multiplex detectó GADA en el 76,2% de los pacientes e IA-2A en el 52,38% (sensibilidad analítica: 88,24 y 56,25% respectivamente,y especificidad: 85,71%) y tTgA en el 42,86% (sensibilidad analítica: 50,0%, y especificidad: 80,0%). Estos resultados se contrastaron con el ensayo de unión de radioligando para GADA e IA-2A y se detectaron 80,95 y 76,19% de los sueros respectivamente (especificidad: 100%), y con un ELISA para tTgA se detectó un 38,1% (especificidad: 97,1%). Conclusiones: FloCMIA multiplex permitió detectar y discriminar GADA, IA-2A y/o tTgA, -en un único acto analítico- en sueros de pacientes con DMA y/o EC. El novedoso inmunoensayo desarrollado simplifica el screening de la población a gran escala

Introduction: autoimmune diabetes mellitus (ADM) and celiac disease (CD) are chronic, polygenic and multifactorial diseases associated with immune system dysfunction. As it is frequent that a patient presents both pathologies, the simultaneous detection of autoimmunity markers of ADM and CD would be a rational strategy to improve the diagnosis. Objectives: to develop an immunoassay based on Flow Cytometry (FloCMIA multiplex) for the simultaneous and discriminative detection of markers for ADM (GADA and IA-2A) and CD (tTgA). Materials and methods: thirty five serum samples of control individuals and 21 type 1 diabetes mellitus (T1DM) patients were assayed. A "double bridge" model was used for the assay, incubating the serum samples with a mixture of microspheres containing different amount of internal fluorescence, each one adsorbed with an autoantigen: TrxGAD, TrxIA-2 or H6-tTg, and a mixture of the same biotinilated autoantigens. The immunocomplexes were detected using streptavidinphycoerytrin and then acquired in a flow cytometer. Results: FloCMIA multiplex detected GADA in 76.2% of the patients; IA-2A in 52.38% (analytical sensitivity: 88.24% and 56.25% respectively, and specificity: 85.71%) and tTgA in 42.86% (analytical sensitivity: 50.0%, and specificity: 80.0%). These results were compared with the radioligand binding assay for GADA and IA-2A, detecting 80.95% and 76.19% of the serum samples respectively (100% specificity), and with an ELISA for tTgA detecting 38.1% (97.1% specificity). Conclusions: FloCMIA multiplex allowed detecting and discriminating GADA, IA-2A and/or tTgA, -in a single assay- in serum samples of ADM and/or CD. The novel developed immunoassay simplifies the screening of the large scale population

Detección y caracterización de autoanticuerpos anti-ZnT8 en pacientes argentinos con diabetes mellitus tipo 1 / Detection and characterisation of zinc transporter 8 autoantibody in Argentinian patients with type 1 diabetes mellitus

Introducción y objetivos: El transportador de Zn8 (ZnT8), identificado como el cuarto autoantígeno inmunodominante en la diabetes mellitus (DM) tipo 1, presenta un polimorfismo en el residuo 325 (Arg/Trp). Sin embargo, aún no se encuentra suficientemente definido el papel de este residuo en la inmunorreactividad de los autoanticuerpos anti-ZnT8 (ZnT8A). En este contexto, el objetivo del presente trabajo involucró la detección y caracterización inmuno-química de los ZnT8A en DM tipo 1 empleando diferentes variantes antigénicas de ZnT8 con Arg o Trp en la posición 325, o bien construcciones quiméricas con ambos aminoácidos en dicha posición. Materiales y métodos: Se evaluaron 100 sueros de pacientes argentinos con reciente diagnóstico de DM tipo 1. La determinación de ZnT8A se realizó mediante el ensayo de unión de radioligando, utilizando distintas variantes antigénicas: ZnT8-Arg325, ZnT8-Trp325, ZnT8- Arg-Trp325, ZnT8-Arg-Arg325 y ZnT8-Trp-Trp325. Paralelamente se determinó la presencia de los otros marcadores de autoinmunidad para DM por ensayo de unión de radioligando. Resultados: De los 100 pacientes estudiados, 65 fueron ZnT8A+ para al menos alguna de las variantes antigénicas empleadas. Ocho reconocieron todas las formas recombinantes de ZnT8. La mayoría (56) resultaron positivos para el heterodímero (ZnT8-Arg-Trp325), 25 de los cuales reconocieron además el homodímero ZnT8-Arg-Arg325 y el monómero ZnT8-Arg325. Nueve pacientes presentaron únicamente ZnT8A como marcador de autoinmunidad. Por otro lado, los niveles de señales obtenidos con el heterodímero fueron significativamente mayores a los niveles alcanzados empleando cualquiera de las otras variantes antigénicas (mediana 17,99 vs. 10,71; 6,32; 5,66 y 4,44 SD scores para ZnT8-Arg325, ZnT8-Trp325, ZnT8-Arg-Arg325 y ZnT8-Trp-Trp325, respectivamente; p < 0,05, test t de Mann-Whitney). Conclusiones: Se logró caracterizar inmunoquímicamente los ZnT8A presentes en pacientes argentinos con DM tipo 1 empleando diferentes variantes antigénicas de ZnT8. Se observó que la incorporación de ZnT8A, en combinación con los marcadores clásicos, incrementa la sensibilidad diagnóstica de autoinmunidad. La reactividad exclusiva de ZnT8A por las variantes antigénicas que contienen arginina en el residuo 325 evidencia la existencia de epítopes dependientes del aminoácido presente en dicho residuo. Además, la aplicación de variantes diméricas reveló la existencia de epítopes definidos por la estructura cuaternaria de ZnT8. La construcción heterodimérica fue la que mostró la mejor combinación de sensibilidad y especificidad a los fines del screening rutinario de ZnT8A.

Introduction and objectives: The aim of this study involved the detection and immunochemical characterisation of ZnT8 autoantibodies (ZnT8A) in new-onset type 1 Argentinian diabetic patients. Material and methods: One hundred sera from type 1 diabetic patients were tested for ZnT8A. The antigens employed were obtained using cDNA plasmids encoding the C-terminal domains of ZnT8 carrying 325Arg, 325Trp and 3 dimeric constructs (ZnT8-Arg-Trp325, ZnT8- Arg-Arg325 and ZnT8-Trp-Trp325). ZnT8A were assessed by radioligand binding assay (RBA). Other islet-autoantibodies were also tested by RBA. Results: Among the 100 type 1 diabetic patients, the prevalence of ZnT8A was 65.0%, 8 recognized all recombinant forms of ZnT8. Most patients (56) were positive for the heterodimer (ZnT8-Arg-Trp325), being 25 of them also positive for the homodimer ZnT8-Arg-Arg325 and monomer ZnT8-Arg325. Single reactivity against ZnT8A was found in 9.0% of the group. Besides, the highest signal values were obtained with the heterodimeric variant (median 17.99 vs. 10.71, 6.32, 5.66 and 4.44 SD scores for ZnT8-Arg325, ZnT8-Trp325, ZnT8-Arg-Arg325 y ZnT8-Trp-Trp325, respectively; p < 0.05, Mann-Whitney t test). Conclusion: Immunochemical characterisation of ZnT8A present in type 1 Argentinian diabetic patients was accomplished, employing different variants of ZnT8. An increased detection of autoimmunity was found when ZnT8A was employed in combination with the other islet-autoantibodies. The presence of autoantibodies that recognized only constructions containing Arg reveals the existence of epitopes dependent of the amino acid present at residue 325. Furthermore, application of dimeric constructions revealed the existence of quaternary structure-defined epitopes which were recognized by type 1 diabetic patients. Finally, the highest combined sensitivity and specificity for routine screening of ZnT8A was accomplished with the heterodimeric construction.

The catechin flavonoid reduces proliferation and induces apoptosis of murine lymphoma cells LB02 through modulation of antiapoptotic proteins

Flavonoids are products of secondary metabolism of plants. They are present in herbs and trees and also act as natural chemopreventives and anticancer agents. Ligaria cuneifolia (Ruiz & Pav.) Tiegh., Loranthaceae, is a hemiparasite species that belongs to Argentine flora. Phytochemical studies have disclosed the presence of quercetin, catechin-4β-ol and pro-anthocyanidine as polyphenolic compounds in the active extracts. We previously demonstrated that ethyl acetate extract was capable of reducing cell proliferation and inducing apoptotic death of lymphoid tumor cells. The aim of the current study is to determine whether or not catechin, isolated from L. cuneifolia extracts can induce leukemia cell death and to determine its effect on the cytoplasmatic proteins that modulate cell survival. Our results show that catechin can reduce proliferation of murine lymphoma cell line LB02. The effect is mediated by apoptosis at concentrations upper to 100 µg/mL. Cell death is related to the loss of mitochondrial membrane potential (ΔΨm) and a down regulation of survivin and Bcl-2 together with the increase of pro-apoptotic protein Bax. In summary, the current study indicates that catechin present in the extract of L. cuneifolia is in part, responsible for the anti-proliferative activity of whole extracts by induction of ΔΨm disruption and modulation of the anti-apoptotic proteins over expressed in tumor cells. These results give new findings into the potential anticancer and chemopreventive activities of L. cuneifolia.